優(yōu)化、培養(yǎng)原代LYCO和LYCT細胞條件技術分享

原文標題：Establishment and characterization of the gonadal cell lines derived from large yellow croaker (Larimichthys crocea) for gene expression studies.

 Doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737300

發(fā)表文章單位：集美大學水產(chǎn)學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室     

背景：魚類細胞系在資源保護、遺傳育種、疾病防治、環(huán)境污染物檢測等方面具有重要的應用價值。性腺細胞系的建立將為研究性別決定的分子調(diào)控機制以及性別相關基因的表達和功能提供合適的體外模型。

方法：采用改良Leibovitz L-15培養(yǎng)基，從幼魚的卵巢和精巢中分別建立了大黃魚卵巢細胞系（LYCO）和精巢細胞系（LYCT）。再通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件以提高LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力，包括ZETA-life胎牛血清（FBS）濃度、不同傳代比例、凍存和復蘇等。

結果：采用電穿孔法成功地將pEGFP-N1和pNanog-N1轉染到細胞系中，細胞的轉染效率較高，表明該細胞系可用于研究外源基因和內(nèi)源基因的表達。LYCO表達卵泡細胞的標記基因Foxl 2，而LYCT表達睪丸支持細胞的標記基因Dmrt 1，且LYCO和LYCT不表達生殖細胞標志基因Vasa。表明LYCO和LYCT分別由卵泡細胞和睪丸支持細胞組成。在LYCO和LYCT中分別敲低Dmrt 1和Foxl 2后，獲得的細胞系可有效用于RNA介導的干擾（RNAi）實驗和基因間相互作用的研究。

結論：作為第一個獲得的魚類性腺細胞系。本研究為大黃魚體細胞與生殖細胞的相互作用提供了一種新的模型，為大黃魚生殖細胞的進一步研究奠定了基礎。本研究結果為今后海水魚類性腺細胞培養(yǎng)的研究奠定了基礎。
文章引用：

Primary culture and subculture

When the primary cells were fully expanded, the subculture was started with a 0.25% trypsin digestion method, and the cell culture bottle was gently turned back and forth. The trypsin was sucked out after most of the cells became round, then 3 mL of new culture medium and 2mL of old culture medium were added again. The cells were gently transferred to the new culture bottle for constant temperature culture.The FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500) concentration remained at 16.7% in the early stage of cell culture and gradually decreased to 10% FBS when the cells were passed to passage 20 (P20),and the morphology turned good. During the first 30 subcultures, the cells were split at a ratio of 1:2 every 2–3 days.    

結果引用:

以澳洲胎牛血清FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)血清進行的LYCO和LYCT的原代培養(yǎng).A和B分別表示第2天和第5天的LYCO原代培養(yǎng)細胞; C和D分別表示第5天和第7天的LYCT原代培養(yǎng)細胞。隨著傳代的進行，LYCO主要由卵巢體細胞和生殖細胞（卵細胞等）組成。繼代培養(yǎng)后，LYCT的形態(tài)沒有明顯變化，擴增速度加快。3-4 d內(nèi)子代細胞覆蓋率達100%。目前，細胞已穩(wěn)定傳代至第80代（P80）。

E和F分別顯示在LYCO和LYCT中用pNanog-N1轉染后的綠色熒光蛋白（GFP）。檢測到強烈的綠色熒光信號，證明轉染效率高。G表示用不同濃度的澳洲胎牛血清FBS(Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)培養(yǎng)LYCO和LYCT。發(fā)現(xiàn)細胞幾乎不在含0%和5%FBS的培養(yǎng)基中擴增。當FBS濃度為10%、15%、20%時，細胞能正常生長并充分增殖。當FBS濃度為15%或20%時，細胞迅速擴增，覆蓋率可達90%。因此，在早期細胞培養(yǎng)中，可選擇含15%或20% FBS的培養(yǎng)基。

原文培養(yǎng)原代大黃魚卵巢細胞（LYCO）和大黃魚精巢細胞（LYCT）方法總結
通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件以提高LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力。其中包括使用不同濃度的胎牛血清（FBS，Zeta life, Australia Origin, Z7010FBS-500）來進行優(yōu)化，為研究出最佳LYCO和LYCT的生長速度和增殖能力提供可靠數(shù)據(jù)。研究證明當FBS濃度為15%或20%時，細胞迅速擴增，覆蓋率可達90%。因此，在早期細胞培養(yǎng)中，可選擇含15%或20% FBS的培養(yǎng)基。

引用產(chǎn)品

胎牛血清fetal bovine serum (Zeta life, USA) ；

熱門產(chǎn)品
Z7010FBS-500,胎牛血清（澳洲血源）；Z7181FBS-500,胎牛血清（烏拉圭血源）；Z7186FBS-500,胎牛血清（法國血源）；Z7185FBS-500,胎牛血清（巴西血源）；Z7187FBS-500,胎牛血清（墨西哥血源）；Z7180FBS-500,胎牛血清（超低內(nèi)毒素血清）；AD600150，Advanced DNA RNA 細胞轉染試劑；AV500150，小動物活體轉染試劑Advanced DNA RNA；CE80100T，無血清細胞凍存液 Plus ZT10002-5ml，支原體去除試劑(MRA)
ZETA life FBS（胎牛血清）簡介：
  美國ZETA life公司成立于1989年，是國際無血清細胞培養(yǎng)基DMEM/F12主要完成人，有幾十年的胎牛血清、無血清細胞培養(yǎng)基、以及干細胞、免疫細胞及腫瘤細胞等多種不同類型哺乳動物細胞的無血清培養(yǎng)液生產(chǎn)經(jīng)驗；ZETA life也是目前世界胎牛血清、無血清培養(yǎng)基最大的OEM供應商之一；每批血清均有完整的血源證明文件、獸醫(yī)師檢驗證明及品質(zhì)測試報告；ZETA life胎牛血清在100級的無菌間采用全自動方式制造生產(chǎn)，具有良好的可再現(xiàn)性及可追溯性。